關(guān)于內(nèi)毒素檢測(cè)，你需要知道的那些事！

什么是細(xì)菌內(nèi)毒素？

細(xì)菌內(nèi)毒素系指細(xì)菌的死體或細(xì)菌代謝物，細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分是產(chǎn)生革蘭素陰性菌細(xì)胞外壁層的脂多糖類物質(zhì)，其活性主要源于其結(jié)構(gòu)中的類脂A。細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中，各種細(xì)菌的內(nèi)毒素大致相同，可以引發(fā)熱，微循環(huán)障礙，內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等。因此，生物制品類，注射用藥劑，抗生素疫苗類等制劑以及醫(yī)療器材類必須經(jīng)過(guò)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試驗(yàn)，合格后才能使用。

內(nèi)毒素的生物學(xué)活性 

內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體可產(chǎn)生致病作用 ，它作為外源性 致 熱 原作 用 于 粒 細(xì) 胞 和 單 核 細(xì) 胞 等 ，使 之 釋 放 內(nèi)源性致熱原 ，引起發(fā)熱；它可激活血管活性物質(zhì)的釋放 ，使末梢血管擴(kuò)張，通透性增高 ，靜脈回流減少，心臟輸出量減低 ，導(dǎo)致低血壓并發(fā)生休克；因組織供血不足缺氧，導(dǎo)致代謝性酸中毒；同時(shí)，它可活化凝血因子Ⅻ ，導(dǎo)致彌漫性血管內(nèi)凝血 (dissemina— tedintravascularcoagulation，DIC)；此 外 內(nèi)毒 素 還 可 引起 施 瓦 茲 曼 現(xiàn) 象 (Shwartzmanphenomenon)。另 一 方 面 它 又 可 發(fā) 揮 諸 多對(duì)機(jī)體有益的生物學(xué)活性 ，適 量的 內(nèi)毒素可增強(qiáng)機(jī)體 非特 異性免疫的作用，能夠抗感染 、抗輻射 ，并能夠增強(qiáng) 網(wǎng)狀 內(nèi)皮細(xì) 胞 的 活 力 ，并 具 有使 腫瘤 壞 死 消 退 的 活 性 。

內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)的現(xiàn)狀

目前 較 為常 用 的 內(nèi) 毒 素 檢 測(cè) 方 法 多基 于 LAL 測(cè) 定 之 上 。鱟 是 一 種 海 洋 生 物 ，其 血 細(xì) 胞 內(nèi)含 有 對(duì) 內(nèi)毒 極 其 敏 感 的凝 血 系 統(tǒng) ，鱟試 驗(yàn) 是 根 據(jù) 鱟 血 提 取 液 能被 皮 克 (pg)水平 的 內(nèi) 毒 素 凝 膠 化 的原理 ，通過(guò)檢測(cè)凝膠的形成來(lái)檢測(cè) 內(nèi)毒 素。我國(guó)藥典 規(guī)定 的 細(xì) 菌 內(nèi)毒 素 定 量 測(cè) 定 法 為 濁 度 法 (TurbidimetricTechnique) 和 顯 色 法，除 此 之 外 內(nèi)毒 素 檢 測(cè) 還 有 凝 膠 法 。

                                                     1 凝 膠 法   

本方 法主 要是待 檢 樣 品和 鱟試劑 各 0．1ml混 合 。37℃ 、6O分 鐘 反 應(yīng) 后 ，18Omin倒轉(zhuǎn) ，根 據(jù) 凝 膠 形 成 的情 況 判 定 的一種半定 量法。此法操作 比較簡(jiǎn)單 、經(jīng)濟(jì) ，而且 不 需要 儀 器 。0．03-EU／ml的 范 圍 內(nèi)進(jìn) 行 半定 量 測(cè) 定 。

                                                              2 濁 度 法   

根 據(jù) 內(nèi) 毒 素 與 鱟試 劑 的 C 因 子 發(fā) 生 反 應(yīng) ，由 內(nèi) 毒 素 引 發(fā) 激 活 的 凝 固 酶 ，切 斷 凝 固 蛋 白原 中 的精 氨 酸 肽 鏈 ，形 成凝 固蛋 白從而產(chǎn) 生凝膠過(guò) 程 中的濁度變化 ，是用濁度儀定 量 的 方 法 ，此 法操 作 比 較 簡(jiǎn) 單 、經(jīng) 濟(jì) ，靈敏 度 較 高 ，檢 測(cè) 范 圍 較 大 (0．006—300EU／m1)。根 據(jù) 測(cè) 定 原 理 的 不 同 又 可 分 為 終 點(diǎn) 法 (EndopointTurbidimetricMethod)和 動(dòng) 態(tài) 法 (KineticTurbidi metricMethod)。終 點(diǎn) 濁 度 法 是 根 據(jù) 到 達(dá) 規(guī) 定 時(shí) 間 點(diǎn) 上 反 應(yīng) 液 的 終 濁 度 值 與 細(xì) 菌 內(nèi)毒 素 濃 度 成 比 例 的 關(guān) 系 的 一 種 檢 測(cè) 方 法 。動(dòng) 態(tài) 濁 度 法 是 根 據(jù) 測(cè) 定 到 達(dá) 事 先 設(shè) 定 的 反 應(yīng) 液 的 濁度 變 化 所 需 要 的 時(shí) 間 的對(duì) 數(shù) 值 與 細(xì) 菌 內(nèi)毒 素 濃 度 的 對(duì) 數(shù) 值 成 反 比例 關(guān) 系 的 一種 分 析 方 法 。本 方 法 因 有 配 套 儀 器 而 較 為 廣 泛 地 應(yīng) 用 于 藥物 檢 測(cè) 及 臨 床 。

                                                             3 比 色 法  

根 據(jù) 被 測(cè) 內(nèi)毒 素激 活 的 凝 固酶 水 解 外 加 鱟 三 肽 (如 ：B0C—IEU—GIY—ARG-PNA 等 )中 的 精 氨 酸 肽 鏈 ，釋 放 出 黃 色 的對(duì) 硝 基 苯 胺 (PNA)，用 冰 醋 酸 終 止 反 應(yīng) 進(jìn) 行 吸 光 度 測(cè) 定 ，或 用 游 離 的 PNA 和 偶 氮 試 劑 反 應(yīng) ， 終 形 成 紅 色 的 偶 氯 藍(lán) 復(fù) 合 物 而進(jìn) 行檢 測(cè) 的 一 種 方 法 。它 也 分 為終 點(diǎn) 法 和 動(dòng) 力 學(xué) 法 。此 法 操 作 較 復(fù) 雜 ，但 靈 敏 度 和 精 密 度 都 較 高 ，目前 也 較 為 常 用 。
   

                                                     4 酶 聯(lián) 免疫 吸 附 測(cè) 定 法 

主 要是 利 用 內(nèi) 毒 素 作 為外 源 性 致 熱 原 的 生 物 學(xué) 活 性 ，通 過(guò) 對(duì) 內(nèi)毒 素刺 激 巨噬 細(xì) 胞 后 產(chǎn) 生 的 內(nèi)源 性 致 熱 原 (如 TNF，IL一1等 )進(jìn) 行 檢 測(cè) ，從 而 對(duì) 內(nèi)毒 素進(jìn) 行定 量檢 測(cè) 。
 

                                                  5 流 式 細(xì) 胞 術(shù)(flow cytometry)

是 應(yīng) 用 針 對(duì) 內(nèi) 毒 素 表 面抗 原 決 定 簇 的 單 克 隆抗 體 (如 抗 LPS單 克 隆 抗 體 )對(duì) 內(nèi)毒 素 進(jìn) 行 熒 光 標(biāo) 定 而 后 應(yīng) 用 流 式 細(xì) 胞 儀 進(jìn) 行 檢 測(cè) 的 一 種 方 法 。本 方 法 不 同于 其 它 方 法 之 處 在 于 它 所 測(cè) 定 的 是 內(nèi) 毒 素 的 量 而 不 是 活 性 。

                                                   6 化學(xué)發(fā)光測(cè)定法

應(yīng)用 CR1 和 CR3受 體 誘 導(dǎo) 中性 粒 細(xì) 胞 的 氧 化 反 應(yīng) 作 為 一 個(gè) 反 應(yīng) 平 臺(tái) ， 通過(guò) 測(cè)定 內(nèi)毒素對(duì) 中性 粒細(xì)胞 的 生物學(xué)作 用來(lái) 檢測(cè) 內(nèi)毒素 的水平 。

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